RESUMO: Esta pesquisa teve como objetivo detectar diretamente em amostras de leite contaminado artificialmente Staphylococcus coagulase positiva (ECP) por multiplex PCR (mPCR). Cepas padrão e isolados de S. aureus, S. epidermidis, S. hyicus, S. intermedius, Listeria monocytogenes e Escherichia coli foram utilizados no estudo. Foram utilizados primers específicos para o gene nuc (NUC1-NUC2 para o S. aureus, NUC3-NUC4 para o S. hyicus e NUC5-NUC6 para o S. intermedius ). Foi possível detectar as três espécies-alvo por mPCR, formar diretamente nas amostras de leite integral bovino, com especificidade adequada e limite de detecção aceitável para identificação de espécies de Staphylococcus coagulase positiva (ECP) em alimentos. A especificidade foi determinada por meio da amplificação de fragmentos específicos das espécies e o limite de detecção foi avaliado pelos limiares de detecção obtidos para as três espécies (103 UFC mL-1 para as espécies presentes nas amostras de leite contaminadas artificialmente).

ABSTRACT: This research aimed to detect coagulase-positive Staphylococcus (CPS) directly in samples of artificially contaminated milk, using multiplex PCR (mPCR). Standard and isolated bacterial strains of S. aureus, S. epidermidis, S. hyicus, S. intermedius, Listeria monocytogenes and Escherichia coli species were used, evaluating the specificity and detection limit of mPCR, for artificially contaminated UHT milk. Primers specific for the nuc gene (NUC1-NUC2 were used for S. aureus, NUC3-NUC4 for S. hyicus and NUC5-NUC6 for S. intermedius). It was possible to detect the three target species by mPCR, directly from bovine whole milk, with adequate specificity and acceptable detention limit for identification of coagulase-positive Staphylococcus (CPS) in foods. The specificity was determined by the amplification of species-specific fragments, and the detection limit was assessed by the detection thresholds obtained for the three species (103 CFU mL-1). From these results, the mPCR described, with the proposed set of primers, has the potential for use in precise identification and differentiation between CPSs in milk samples.

RESUMOIntrodução: A maioria das infecções fúngicas hospitalares são causadas por Candida spp. e C. albicans é a espécie mais comumente identificada. Métodos moleculares são ferramentas importantes para a avaliação da origem das leveduras isoladas em hospitais.Métodos: Este é um estudo sobre o perfil genético de 39 isolados clínicos nosocomiais de C. albicans através das técnicas de RAPD e microssatélite, foram usados dois diferentes iniciadores para cada técnica.Resultados: RAPD forneceu 10 e 11 diferentes perfis com valores de SAB 0,84 ± 0,126 e 0,88 ± 0,08 para os primers M2 e P4, respectivamente. A análise de microssatélites, usando os marcadores CDC3 e HIS3 permitiu a observação de seis e sete diferentes alelos respectivamente, com poder discriminatório combinado de 0,91.Conclusões: Embora seja clara a variabilidade genética, foi possível identificar alta similaridade, sugerindo origem comum para pelo menos parte deles. É importante enfatizar que foi comprovada origem comum de leveduras isoladas de colonização (urina, cateter ou secreção orotraqueal) e hemocultura do mesmo paciente, indicando que a candidemia deve ter iniciado a partir de um sítio de colonização. A combinação das técnicas RAPD e microssatélites fornece uma análise rápida e eficiente para investigação de similaridade entre isolados nosocomiais de C. albicans.

SUMMARYIntroduction: The majority of nosocomial fungal infections are caused by Candida spp. where C. albicans is the species most commonly identified. Molecular methods are important tools for assessing the origin of the yeasts isolated in hospitals.Methods: This is a study on the genetic profifiles of 39 nosocomial clinical isolates of C. albicans using two typing methods: random amplifified polymorphic DNA (RAPD) and microsatellite, two different primers for each technique were used.Results: RAPD provided 10 and 11 different profiles with values for SAB of 0.84 ± 0.126 and 0.88 ± 0.08 for primers M2 and P4, respectively. Microsatellite using two markers, CDC3 and HIS3, allowed the observation of six and seven different alleles, respectively, with combined discriminatory power of 0.91.Conclusions: Although genetic variability is clear, it was possible to identify high similarity, suggesting a common origin for at least a part of isolates. It is important to emphasize that common origin was proven from yeasts isolated from colonization (urine, catheter or endotracheal secretions) and blood culture from the same patient, indicating that the candidemia must have started from a site of colonization. The combination of RAPD and microsatellite provides a quick and efficient analysis for investigation of similarity among nosocomial isolates of C. albicans.

As espécies enterotoxigenicas Staphylococcus aureus, S. hyicus e S. intermedius apresentam características muito similares, tornando difícil a sua identificação através dos métodos microbiológicos convencionais. Este trabalho visou o desenvolvimento de um PCR multiplex (mPCR) para a identificação S. aureus, S. intermedius and S. hyicus, utilizando, para isso, sequencias do gene nuc. Os resultados obtidos sugerem que os primers utilizados foram específicos para as três espécies de Staphylococcus avaliadas, com um limite de detecção de10² UFC.mL-1.

The enterotoxigenic species Staphylococcus aureus, S. hyicus and S. intermedius show very similar characteristics, making their identification through conventional microbiological methods difficult. This study aimed at the development of a Multiplex PCR (mPCR) for the identification of S. aureus, S. intermedius and S. hyicus using the nuc gene as the target sequence. The results obtained suggest that the set of primers used was specific for the three species of Staphylococcus evaluate with a detection limit of 10² CFU.mL-1.

A broca da cana, Diatraea saccharalis pertence à família dos lepidópteros. A presença da larva pode ser extremamente destrutiva, chegando a inviabilizar a atividade canavieira, causando prejuízos consideráveis à agroindústria sucro-alcooleira. Atualmente a broca da cana vem sendo extinta da plantação por métodos de controle biológico, entretanto a evolução desses programas depende de maiores conhecimentos básicos da biologia molecular deste inseto. O estudo do segmento do genoma mitocondrial denominado região controle é amplamente utilizado em análises genéticas e filogenéticas em insetos. O objetivo desse trabalho foi sequenciar e analisar a região controle do genoma mitocondrial de Diatraea saccharalis. Esse segmento apresentou 338 nucleotídeos, menor que o observado em Bombyx mori, com conteúdo de 93,5% de A/T. As analises realizadas mostraram que Diatraea saccharalis apresenta 76% de similaridade com Cydia pomonella.

This study aimed at the sequence and analysis of the mtDNA control region (CR) of the Diatraea saccharalis. The genome PCR amplification was performed using the complementary primers to the flanking regions of Bombyx mori CR mitochondrial segment. The sequencing revealed that the amplified product was 568 bp long, which was smaller than that observed for B. mori (725 bp). Within the amplified segment, a sequence with 338 nucleotides was identified as the control region, which displayed a high AT content (93.5%). The D. saccharalis mtDNA CR multiple sequence alignment analysis showed that this region had high similarity with the Lepidoptera Cydia pomonella.

We determined the genome size of the Brazilian sciarid flies Bradysia hygida, Rhynchosciara americana and Trichosia pubescens (Diptera: Sciaridae) using absorbance measurements of Feulgen-stained nuclei belonging to these species (and chicken erythrocytes as a standard) to calculate the amount of DNA in picograms (pg) and the number of base pairs (bp), or C-value, for each of these species. The C-values were: 3 x 10(8) bp (0.31 pg) for B. hygida; 3.6 x 10(8) bp (0.37 pg) for R. americana; and 1 x 10(9) bp (1.03 pg) for T. pubescens. The sciarids investigated in this work had considerably higher C-values than the average for previously described dipteran species, including D. melanogaster.

Observações à microscopia eletrônica e estudos bioquímicos de cromossomos e núcleos sem histonas tem suportado a hipótese que o DNA de eucariotos é organizado em alças associadas com o esqueleto cromossômico ou à matriz nuclear. A observação da matriz nuclear sem a remoção do DNA, através da digestão com enzimas de restrição, apresenta uma figura em halo que representa a liberação das alças de DNA. Um protocolo para a obtenção de halos nucleares de núcleos politênicos de insetos, através da extração de proteínas usando o detergente LIS, é reportado nesse trabalho. Foram realizadas análises utilizando-se microscopia de fluorescência e microscopia de varredura confocal a laser. A extração de halos nucleares foi possível somente com o isolamento da fração nuclear em tampão sem espermina e espermidina. A obtenção de halos nucleares de núcleos politênicos de glândula salivar de Bradysia hygida contribui significativamente para o estudo da estrutura e função dessas organelas tão especiais.

A protocol for recovered nuclear halos from insect polytene nuclei after the extraction of the nuclear proteins using LIS detergent is reported in this work. Analysis was carried out using fluorescence and confocal laser scan microscopy. The extraction of nuclear halos was possible only with nuclei-fraction isolation in hypotonic buffer without spermine and spermidine. The recovered nuclear halos from Bradysia hygida salivary gland polytene nuclei, contributed greatly to the study of the structure and function of these special organelles.